Asian Symoposium on Microbial Ecology was held in Shizuoka, Japan in 2023. I served as a session chair, Dr Song gave a presentation at young scientist session and got Award (congratulations!!), and Geon presented a poster about colistin resitant E. coli. We visited Prof. Shintani at Shizuoka University and learned a lot about plasmid biology.
1차 PCR
준비물 : 96well PCR plate, PCR plate seal, V4 Primer (Forward, Reverse), KAPA HiFi Hot Start Ready Mix
샘플 1개 기준
Forward Primer (10 pmol) : 5ul
Reverse Primer (10 pmol) : 5ul
KAPA HiFi : 12.5ul
95℃ 3m, 25cycle of 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s, 72℃ 5m, Hold at 12℃
준비물 : 96well cell culture plate 4개 , HiAccu Beads, 80% EtOH, 10mM Tris buffer, Magnetic Extractor & cover, Magnetic Ring stand
준비물 : 96well PCR plate, PCR plate seal, Illumina Index Primer(B set or Cset), KAPA HiFi Hot Start Ready Mix, DNAase Free Water
DNAase Free water : 10ul
Index Primer Forward : 5ul
Index Primer Reverse : 5ul
1차 Clean-up product : 5ul
KAPA HiFi : 25ul
95℃ 3m, 8cycle of 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s, 72℃ 5m, Hold at 12℃
준비물 : 96well cell culture plate 4개 , HiAccu Beads, 80% EtOH, 10mM Tris buffer, Magnetic Extractor & cover, Magnetic Ring stand
1) qPCR 준비 및 작동
준비사항: DNA샘플 & Standard plasmid샘플, Forward-primer, Reverse-primer, DNase-free water, SYBG premix (아이스블럭에 보관), 아이스블럭, qPCR전용 튜브
| 재료 | 샘플당 넣는 양 | 샘플 갯수 | 넣는 양 |
| DNA | 1 µℓ | 각 PCR tube에 따로 넣어줌 | |
| D.W | 7 µℓ | X (샘플 갯수+1) | 7 X (샘플 갯수+1) µℓ |
| F-primer | 1 µℓ | 1 X (샘플 갯수+1) µℓ | |
| R-primer | 1 µℓ | 1 X (샘플 갯수+1) µℓ | |
| SYBG premix | 10 | 10 X (샘플 갯수+1) µℓ | |
| 총량 | 20 µℓ | e-tube에 혼합 |
1) PCR 준비 및 작동
준비사항: DNA샘플, Forward-primer, Reverse-primer, DNase-free water, PCR premix tube
| 재료 | 샘플당 넣는 양 | 샘플 갯수 | 넣는 양 |
| DNA | 1 µℓ | 각 PCR tube에 따로 넣어줌 | |
| F-primer (10 pmol) | 1 µℓ | X (샘플 갯수+1) | 1 X (샘플 갯수+1) µℓ |
| R-primer (10 pmol) | 1 µℓ | X (샘플 갯수+1) | 1 X (샘플 갯수+1) µℓ |
| D.W | 17 µℓ | X (샘플 갯수+1) | 17 X (샘플 갯수+1) µℓ |
| 총량 | 20 µℓ | e-tube에 혼합 | |
2) 전기영동
| Target size (bp) | Gel 농도 | TAE buffer (mL) | Agarose (g) |
| 500이하 | 3% | 25 | 0.75 |
| 75 | 2.25 | ||
| 150 | 4.5 | ||
| 500~5,000 | 1% | 25 | 0.25 |
| 75 | 0.75 | ||
| 150 | 1.5 | ||
| 5,000이상 | 0.7% | 25 | 0.18 |
| 75 | 0.53 | ||
| 150 | 1.05 |
실험 1주일 전에 모든 배지 제조
Day 0
다음의 배지를 준비한다.
*XLD 와 mEnterococci 배지에 NaCl 3% W/V을 첨가한다.
*각 배지에 Oxytetracycline 4 ug/ml을 첨가한다.
* NaCl, 3% W/V을 첨가한다.
Day 1.
0.2 um 크기의 MCE Membrane filter를 이용하여 배출수를 20 ml, 10 ml, 5ml씩여과한다. 여과지를 6cm TCBS, XLD, MA(Marine agar), mEnterococci 플레이트에 각각 올린다. TCBS, MA, XLD 플레이트는 35 OC에 24 시간 배양하고, mEnterocci 플레이트는 35OC에 36-48 시간 배양한다.
Day 2.
Membrane filter를 배양한6cm TCBS, XLD, MA, mEnterococci 배지에서 각각 60개의 다양한 콜로니를 선별하고 9 cm 배지에 Streaking한다. (4개의 콜로니를 한 플레이트에 도말.) 플레이트를 배양한다.
Day 3.
96 well cell culture plate에 TSB 혹은 MHB를 약 200 ul씩 분주 한 후, 선별한 60개의 개별 콜로니를 배양한다.(배지 한 종류 당 플레이트 하나 이용; 총 240 콜로니) 또한 E. coli strain ATCC 25922 을 quality control로서 사용하여 각 플레이트에 배양한다.
Day 4.
96 well cell culture plate에 배양한 미생물들을 멸균된 replicator을 이용하여 항생제가 포함된 6개의 MHA에 배양한다.
Day 5.
MHA플레이트에서의 성장 유무를 확인하고 개체의 항생제 저항성과 감수성을 관찰한다.
3% W/V NaCl이 첨가된TSA(Trypticase Soy Agar) (9 cm)를 항생제 내성을 보이는 개체수 만큼 준비한다. 2일간 배양하여 TSA배지로부터 얻은 각각의 MDR 콜로니를 플라스미드 프로파일링을 위한 새 TSA배지로 접종한다 (단일 콜로니 당 배지 하나.)
*( mEnterococci도 작업하는 경우 약 7-8일이 소요될수 있음)
Illumina Miseq을 이용하여 미생물 생태를 분석한다고 했지만 도대체 어떻게 수 많은 DNA를 시퀀싱하는 것일까요? 그렇다면, 원래 시퀀싱은 어떻게 이루어지는 것일까요? 아시다시피 DNA는 4개의 염기라고 불리는 A, T, G, C가 random하게 이어진 것입니다. 시퀀싱은 이렇게 이어진 염기들의 순서를 찾기 위한 방법입니다.
자, 그러면 어떻게 DNA의 염기서열을 특정할 수 있을까요? 과거부터 사용되었던 방법은 Sanger(생거) 시퀀싱입니다. 이 방법은 하나의 DNA를 시퀀싱 할 때 사용되는데, 쉽게 설명해드리죠.
우선 머리속으로 4개의 시험관을 준비하세요. 지금부터 시험관에서 DNA를 늘릴것입니다. 방법은 PCR과 같습니다. 프라이머 A, T, G, C 염기와 DNA 중합 효소를 넣습니다. DNA의 합성이란 프라이머가 DNA에 달라붙어 DNA 중합효소가 프라이머를 늘릴 수 있도록 주위에 있는 A, T, G, C를 붙여가는 것입니다. 물론 random 하게 붙여지는 것이 아니라 A-T, G-C의 상호관계를 유지하면서 붙여지게 됩니다.
여기에서 아까 머리속으로 그려놓은 4개의 시험관에 A, T, G, C를 조금 더 세밀하게 섞어 넣습니다. 원래의 염기는 dNTP이고 세밀하게 섞은 것은 ddNTP입니다. 이 작업은 염기가 더 이상 붙지 않게 하기 위한 작업입니다. 따라서 첫번째 시험관에는 dNTP와 A가 세밀하게 섞인 것, 두 번째는 T가 섞인 것, 세 번째는 G, 네 번째는 C가 세밀하게 섞인 것입니다. 이 상태에서 DNA합성을 시작하면 각 시험관 안에서 길이가 애매한 것이 생성됩니다. 세밀하게 섞은 염기가 중간에 들어갔기 때문에 합성이 중단되는 거죠. 그래서 이를 전기영동 하면 길이가 다양한 밴드를 확인 할 수 있습니다.
여기서 한 가지 짚고 넘어가보겠습니다. A가 들어간 시험관에서 사용하는 프라이머는 파란색, C가 들어간 시험관에는 녹색, G는 오렌지색, T는 빨간색이라고 가정하고 이 4개의 시험관을 섞어 전기영동 해봅니다. 그러면 마술을 보는 것처럼 1bp 마다 색깔로 염기가 나타나게 됩니다! 여기서 잠깐, 애초에 전기영동에서 1bp의 차이를 해보셨나요? 사실, 이 시퀀싱에서 잡히는 전기영동은 일반에서 사용하는 것과는 다릅니다. 아가로오스 겔 대신 폴리 아크릴 아미드 겔 이라는 것을 사용합니다. 이 경우 1bp의 차이점까지 확인 할 수 있습니다.
이와 같이 염기가 보완적인 관계를 사용하는 방법이 시퀀싱의 기본입니다. 이 방법을 우리는 capillary sequencing 혹은 생거 시퀀싱 이라고 합니다.
Microbiome Lab 